Система детекции EnVision+ Horseradish peroxidase (DAB) (пероксидаза хрена, ДАБ). Резюме и пояснение EnVision+System, HRP это двухэтапный ИГХ метод.



EnVision(+System-HRP (DAB)

Система детекции EnVision(+ Horseradish peroxidase (DAB)
(пероксидаза хрена, ДАБ)

Для использования с первичными мышиными антителами

Код K4006 15 mL
Код K4007 110 mL

Назначение
Для диагностики in vitro.

Данная инструкция прилагается к DakoCytomation EnVision(+System-HRP.

Этот набор предназначен для использования с первичными мышиными антителами, поставляемыми пользователю для качественной идентификации антигенов при световой микроскопии в нормальных и патологически измененных тканях, залитых в парафин, криостатных срезах или клеточных препаратах. Можно использовать ткани, фиксированные этанолом, В-5, Буэном, цинк-формалином и нейтральным забуференным формалином.

Резюме и пояснение
EnVision(+System, HRP это двухэтапный ИГХ метод. Система основана на полимерах, меченных пероксидазой хрена, которая связана с вторичными антителами. Меченые полимеры не должны содержать авидин или биотин. Следовательно, неспецифическая окраска, получающаяся от эндогенной авидин-биотиновой активности, например в печени, почках, лимфоидной ткани и в криостатных срезах элиминируется или значительно ослабевает. Все реагенты EnVision(+System-HRP, кроме жидкого DAB+ субстрат-хромогена готовы к использованию. Эта система чрезвычайно чувствительна и в результате оптимальные разведения первичных антител до 20 раз выше, чем при использовании традиционного РАР-метода ***(Пероксидаза - антипероксидаза)*** и в несколько раз выше, чем при традициооных ABC (avidin-biotin complex = авидин-биотин комплекс) или LSAB ***(Labelled – StreptAvidin-Biotin = меченый – стрептавидин - биотин)*** методов. Этот протокол предлагает усиленную систему генерации сигнала для определения антигенов, представленных в низких концентрациях или для низкого титра первичных антител. Первичные антитела выработаны у мышей реакцией с меченым полимером. Интерпретация любой положительной окраски или ее отсутствия должна дополняться морфологическими и гистологическими исследованиями с соответствующими контролями.

Принципы процедуры
Любая эндогенная пероксидазная активность погашается инкубацией образца 5 минут пероксидазным блоком. Затем образец инкубируется с соответствующими характеристиками и разведениями первичных мышиных антител с последующей инкубацией меченым полимером в 2 последовательных 30-минутных инкубациях. Нужно помнить, что антитела, требующие переваривания ферментами или восстановления антигенов могут потребовать увеличения времени инкубации первичных антител и меченым полимером от 5 до 10 минут. Окраска выполняется 5-10 минутной инкубацией с 3.3'-диаминобензидином (DAB+) субстрат-хромогеном, в результате которой образуется коричневый осадок на участке антигена. (ДАБ – возможный канцероген; см. "меры предосторожности").

Назначение реагентов
Код К4006
Следующие материалы, входящие в набор, достаточны для 150 срезов тканей, в основном по 100 мкл на срез:

Количество Описание
1х15 мл Пероксидазный блок
PEROXIDASE BLOCK
0.03% перекись водорода, содержащая азид натрия

1х15 мл Меченный полимер
LABELLED POLYMER-HRP
ANTI-MOUSE
Полимер, меченный пероксидазой, коньюгированный с козьими анти-мышинными иммуноглобулинами в буфере трис-соляная кислота, содержащий стабилизированный белок и антимикробный агент.

1х18 мл Субстратный буфер
DAB+
SUBSRATE BUFFER
Субстратный буферный раствор, рН 7.5, содержащий перекись водорода и консервант.

1х1 мл ДАБ+ Хромоген
DAB+ Chromogen
Раствор 3.3'-диаминобензидин хромоген.

Код К4007
Следующие материалы, входящие в набор, достаточны для 1100 срезов тканей, в основном по 100 мкл на срез:

Количество Описание
1х110 мл Пероксидазный блок
PEROXIDASE BLOCK
0.03% перекись водорода, содержащая азид натрия

1х110 мл Меченный полимер
LABELLED POLYMER-HRP
ANTI-MOUSE
Полимер, меченный пероксидазой, конъюгированный с козьими анти-мышинными иммуноглобулинами в буфере трис-соляная кислота, содержащий стабилизированный белок и антимикробный агент.

1х120 мл Субстратный буфер
DAB+
SUBSRATE BUFFER
Субстратный буферный раствор, рН 7.5, содержащий перекись водорода и консервант.

1х5 мл ДАБ+ Хромоген
DAB+ Chromogen
Раствор 3.3'-диаминобензидин хромоген.

Дополнительно:
Калиброванный тест-флакон
Пластиковая Пастеровская пипетка.

Материалы необходимые, но не прилагаемые:
Фильтровальная бумага
Контрольные ткани, положительные и отрицательные
Докраски на водной основе, такие как гематоксилин Майера или гематоксилин Лилли (код S3309).
Покровные стекла
Дистиллированная вода
Этанол абсолютный и 95%
Световой микроскоп (20х-800х)
Среда для заключения, такая как Glycergel( Mounting media (код C0563) или Faramount (код S3025) (водная среда) rtu или неводная среда, как Ultramount (код S 1964)
Первичные антитела и отрицательный контрольный реагент
Стекла, покрытые поли-L-лизином или силанизированные (код S 3003)
Сосуды или батарея для окраски
Таймер (3-40 минут)
Промывочная емкость
Промывочный буферный раствор
Ксилол, толуол или заменители

Дополнительные необходимые материалы, но не поставляемые

Аммиак, 15 моль/л разведенный до 0.037 моль/л
РАР карандаш (код S 2002)

Предосторожности
Для профессиональных пользователей
Этот продукт содержит азид натрия (NaN3), химически высокотоксичный в чистом виде. В концентрациях продукта, хотя он и не классифицируется как опасный, соединения азида натрия могут реагировать со свинцовой и медной арматурой водопроводных систем, вызывая образование взрывоопасных оксидов металлов. При сливе в канализацию промывать большими объемами воды для предотвращения формирования соединений азидов в канализации.1,2
Не использовать реагенты с истекшим сроком годности при предписанном способе хранения. Если реагенты хранились в ненадлежащих условиях, или не рекомендованных, их пригодность должна быть подтверждена пользователем.
Не заменять реагенты один на другой из разных наборов и производителей.
Ферменты и субстрат-хромоген могут испортиться, если их хранить на свету. Не хранить компоненты набора или выполнять окраску на сильном свету, например на прямом солнечном свету.
Время инкубации или температура, отличающиеся от рекомендованных, могут дать ошибочные результаты; любые такие изменения должны быть подтверждены пользователем.
Как с любым продуктом, происходящим из биологических источников, должны использоваться соответствующие процедуры обработки.
Надевайте соответствующее персональное защитное оборудование во избежание контакта с глазами и кожей.
Неиспользованные растворы должны утилизироваться в соответствии с местными, областными и федеральными инструкциями.
MSDS должен быть доступен профессиональному пользователю по просьбе.

Риск и положения безопасности
К4006 & K4007 Пероксидазный блок
R22 Вреден при проглатывании
К4006 & K4007 ДАБ хромоген
R40 Ограниченные доказательства канцерогенного эффекта
R43 Может вызвать сенсибилизацию при контакте с кожей
R68 Возможный риск необратимых воздействий
S35 Этот материал и его контейнер должны уничтожаться безопасным способом
S36/37 Одевать соответствующую защитную одежду и перчатки

Хранение
Реагенты DakoCytomation EnVision(+System, HRP хранить при температуре 2-8оС. Не замораживать. Не использовать по истечении срока годности, указанного на этикетках.

Нарушения внешнего вида реагентов, например, осадок, могут свидетельствовать о нестабильности или разрушении реактива. В таких случаях реагент(ы) нельзя использовать.

Приготовление реактивов
Удобно готовить следующие реагенты перед окраской.

Промывочный буфер
В качестве промывочного буфера для автоматической и ручной ИГХ-детекции рекомендуются TBST, 0.05 моль/л Трис-буфер солевой буферный раствор с Tween 20. TBS, 0.05 моль/л трис-буферный солевой раствор (код S 1968) и PBS, 0.02 моль/л фосфатный солевой буфер (код S 3024) также подходят в качестве промывочного буфера для ручной окраски. Не рекомендуется фосфатный буфер, содержащий азид натрия. Азид натрия инактивирует пероксидазу хрена (HRP) и в результате получается отрицательная окраска. Неиспользованный буфер хранят при 2-8оС. Вылить буфер при помутнении.

Можно использовать дистиллированную воду для промывки пероксидазного блока, субстрата и докраски.

Первичное антитело
В DakoCytomation имеются концентрированные антитела; однако, оптимальные разведения должны быть экспериментально определены пользователем. Из-за высокой чувствительности DakoCytomation EnVision+ System, HRP, разведения первичных антител могут быть в 10-20 раз больше, чем используемые в традиционных ИГХ-методах. Разведения должны выполняться 0.05 моль/л Трис-HCl буфером, рН 7.2-7.6, содержащим 1% бычий сывороточный альбумин (Antibody Diluent S 0809). Для большинства первичных антител, используемых с этим набором подходит время инкубации 30 минут.

NP-серия "Plus" готовых к использованию готовых к использованию антител оптимизирована и рекомендуется высокочувствительная система детекции DakoCytomation "Plus". Оптимизация концентрированных антител выполняется конечным пользователем. Разведения должны делаться растворителем антител (Antibody Diluent S 0809) или растворителем, содержащим 0.05 моль/л Трис-HCl буфер, рН 7.2-7.6, с 1% бычим сывороточным альбумином (BSA). DakoCytomation N-серия rtu антител не оптимизирована для использования с системой детекции DakoCytomation "Plus".

Реагент отрицательного контроля
В идеале, реагент отрицательного контроля, содержащий антитело не проявляет специфической реактивности с тканями человека или нормальной/неимунной сывороткой в том же матриксе/растворе, в котором разведено первичное антитело. Реагент отрицательного контроля должен быть того же подкласса и вида животного, что и первичное антитело, разведенное тем же иммуноглобулином или белком в концентрации первичного антитела и тем же растворителем. Период инкубации реагента отрицательного контроля должен соответствовать первичному антителу.

При использовании DakoCytomation NP-серий "Plus" готовых к использованию антител, в качестве отрицательного контрольного реагента рекомендуются универсальные отрицательные контроли+. Эти контроли оптимизированы для использования с мышиными (NP 0015) или кроличьими (NP 001) NP-серии "Plus" готовыми к использованию антителами.

За подробной информацией в отношении приготовления реагента отрицательного контроля обратитесь к разделу "качество контрольного среза".

Субстрат-хромоген раствор
Для 10 срезов тканей или 5 мазков достаточно приготовить 1 мл раствора субстрата-хромогена, согласно следующему протоколу.
ЭТАП 1 В зависимости от количества окрашенных стекол перенесите количество кратное 1 мл буфера субстрата в приложенную мерную тубу.

ЭТАП 2 На каждый 1 мл буфера добавить одну каплю (20 мкл) жидкого ДАБ+ хромогена. Смешать немедленно и накапать на срезы ткани прилагающейся Пастеровской пипеткой.

Приготовленный раствор субстрат-хромогена стабилен примерно 5 дней, если хранится при 2-8оС. Этот раствор нужно тщательно перемешать перед использованием. Любой осадок, появляющийся в растворе не должен влиять на качество окраски.

Тестовый флакон и пипетки необходимо тщательно промывать после каждого использования.

Полное использование 18 мл субстратного буфера с К4006 будет достаточным для обеспечения примерно 150 тестов. Иногда может остаться некоторый объем. Полное использование 120 мл субстрата с К4007 будет достаточным для 1100 тестов. Может остаться некоторый объем.

Докраска
Окрашенный конечный продукт реакции не растворяется в спирте и можно пользоваться спиртовыми или водно-спиртовыми докрасками, такими как гематоксилин Майера или Лилли (S 3309). После докраски гематоксилином следует тщательная промывка и затем стекла помещают в контейнер с 0.037 моль/л аммонием или подобным подсинивающим агентом. 0.037 моль/л раствор аммония готовится смешиванием 2.5 мл 15 моль/л (концентрированного) гидроксида аммония с 1 литром дистиллированной воды.
Неиспользованный 0.037 моль/л аммоний может храниться при комнатной температуре (20-25оС) в тщательно закупоренной емкости до года.
***(2.5 мл 25% раствора аммиака долить водой до 1 литра). Я рекомендую добавлять 2 капли 25% раствора в 200-250 мл емкость со стеклами перед использованием, раствор не хранить и выливать после использования. Еще лучше дать стеклам постоять 2 минуты в обычной водопроводной воде, если ее рН>7. Самый лучший способ подсинивания срезов – фосфатный буфер ***

Обратитесь к инструкциям производителя за альтернативными процедурами докраски.

Подготовка образца
Обратитесь к "Общим инструкциям по иммуногистохимическим окраскам" и/или к листу спецификации антитела.

Перед ИГХ окраской ткани должны быть фиксированы и проведены. Фиксация предотвращает аутолиз и гниение иссеченных тканей, сохраняет антигенность, увеличивает индекс преломления составляющих ткани и устойчивость клеточных элементов к проводке тканей. Проводка ткани включает дегидратацию, просветление дегидратантов, пропитывание заливочной средой, заливку и резку тканей. Большинство фиксаторов для ИГХ-препаратов обсуждается в общих инструкциях. Это только руководство. Оптимальные процедуры должны быть определены экспериментально и верифицированы пользователем.

Процедура окраски
Замечания к процедуре

Пользователь должен прочесть эти инструкции тщательно и ознакомиться с содержимым набора перед использованием.

Реагенты и инструкции, прилагаемые к этому набору, разработаны для оптимального исполнения. Дальнейшее разбавление реагентов набора или нарушение времени инкубации или температур могут давать ошибочные результаты.

Все реагенты должны достичь комнатной температуры (20-25оС) перед ИГХ-окраской. Подобно этому, все инкубации должны выполняться при комнатной температуре.

Не позволяйте срезам ткани высыхать во время окрашивания. Высушенные срезы могут давать усиление неспецифической окраски. Накрытые стекла отбирают. Если необходимо, стекла помещают во влажное окружение.

Чувствительность DakoCytomation EnVision+ System, HRP можно дальше увеличить, удлинением времени инкубации на этапах 2 и 3 до 5-10 минут.

Протокол окраски
Этап 1 ПЕРОКСИДАЗНЫЙ БЛОК
Слить избыток буфера. Используя полоски ткани (такие как промокательные бумаги или марлю) тщательно промокнуть вокруг среза для удаления любых остатков жидкости и удерживания реагента в описанной области. Залить пероксидазным блоком, достаточным для покрытия образца. Инкубировать 5 (±1) минут.
Промыть аккуратно дистиллированной водой или буферным раствором из промывной бутылки (не направлять поток прямо на ткань) и положить в свежую порцию буфера.

ЭТАП 2 ПЕРВИЧНОЕ АНТИТЕЛО ИЛИ РЕАГЕНТ ОТРИЦАТЕЛЬНОГО КОНТРОЛЯ
Слить избыток буфера и промокнуть стекла как раньше. Залить оптимально разведенным первичным антителом или реагентом отрицательного контроля в количестве, достаточным для покрытия среза.
Инкубировать 30 (±1) минут.
Промыть аккуратно дистиллированной водой или буферным раствором из промывной бутылки (не направлять поток прямо на ткань) и положить в свежую порцию буфера.

Если процедуру окраски необходимо прервать, стекла можно держать в буферном растворе после инкубации первичного антитела (этап 2) вплоть до одного часа при комнатной температуре (20-25оС) не влияя на выполнение окраски.

ЭТАП 3 ПОЛИМЕР, МЕЧЕННЫЙ ПЕРОКСИДАЗОЙ
Слить избыток буфера и промокнуть стекла как раньше. Залить меченным полимером, достаточным для покрытия образца. Инкубировать 30 (±1) минут. Промыть стекла как в этапе 2.

ЭТАП 4 СУБСТРАТ-ХРОМОГЕН
Промокнуть стекла как раньше.
Залить приготовленным жидким ДАБ+ субстрат-хромогеном, достаточным для покрытия образца. (См. раздел приготовление реагента).
Промыть аккуратно дистиллированной водой из промывной бутылки (не направлять поток прямо на ткань). Собирать отходы субстрат-хромогена в контейнер с опасными материалами для надлежащего уничтожения.

ЭТПА 5 ДОКРАСКА ГЕМАТОКСИЛИНОМ (необязательно)
Погрузить стекла в гематоксилин (код S 3309). Длительность инкубации зависит от силы используемого гематоксилина.
Аккуратно промыть в дистиллированной воде.
Окунуть стекла 10 раз в 0.037 молярный аммоний или подобный подсинивающий агент.
Промыть стекла в дистиллированной или деионизированной воде 2-5 минут.

ЭТАП 6 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Образцы могут быть заключены под покровное стекло в водорастворимую среду, например Glycergel mounting medium (S 3205) или неводную среду, Ultramount (код S 1964). Стекла можно обезводить и заключить.

Контроль качества
Отличия в проводке ткани и технических процедурах в лабораториях пользователей могут давать значительные отклонения в результатах, требующих регулярного применения внутреннего контроля дополнительно к следующим процедурам. См. руководство по контролю качества Коллегии американских патологов (САР), программы сертификации по иммуногистохимии и ссылки 3-5 за дополнительной информацией. Обратитесь к листу спецификации первичных антител за деталями относительно чувствительности и иммунореактивности.

Обратитесь к "Общим инструкциям по иммуногистохимической окраске" за дальнейшей информацией о положительных и отрицательных контролях.

Интерпретация окраски
Обратитесь к "Общим инструкциям по иммуногистохимическим окраскам" за руководством по интерпретации.

Ограничения
Окраска ткани зависит от правильного обращения и проводки ткани перед окраской. Плохая фиксация, замораживание, оттаивание, промывка, высушивание, нагревание, резка или загрязнение другими тканями или жидкостями могут вызвать артефакты, подчеркивание окраски антител или ложноотрицательные результаты.

Использование старых или незабуференных фиксаторов или перегревание тканей выше 60оС во время проводки могут ослаблять чувствительность антител.

Эндогенная пероксидаза или пероксидазная активность может быть найдена в гемопротеинах, таких как гемоглобин, миоглобин, цитохром и каталаза, а также в эозинофилах.6,7 Эту активность можно подавить инкубацией образцов в пероксидазном блоке DakoCytomation EnVision+ System, HRP за 5 минут перед применением первичного антитела. Кровь и мазки костного мозга и замороженные ткани также можно обрабатывать этим реагентом. Однако эта процедура не удаляет красно-коричневого пигмента гемопротеинов. Или можно пользоваться раствором перекиси водорода. При этой процедуре могут денатурироваться некоторые антигены.

Ткани от людей, инфицированных вирусом гепатита В и содержащие поверхностный антиген гепатита В (HBsAg) могут давать неспецифическую окраску с пероксидазой хрена.8

Нормальная/неимунная сыворотка из того же источника, что и вторичная антисыворотка, используемая в блокирующих этапах может вызвать ложноположительные результаты из-за аутоантител или естественных антител.

Реагенты, поставляемые в этом наборе, разведены оптимально. Дальнейшее разведение может в результате вызвать потерю детекции антигенов.

Обратитесь к "Общим инструкциям по иммуногистохимическим окраскам" за общими ограничениями.

Диагностика
Проблема
Возможная причина
Предложенное действие

1. Нет окраски ни на одном стекле
1а. Реагенты использованы не в нужном порядке
1б. В буферном растворе азид натрия
1а. Пересмотреть применяемые реагенты
1б. Используйте свежий буфер без азида натрия

2. Слабая окраска во всех стеклах
2а. Срезы остаются слишком долго в растворе после промывки

2б. Стекла не инкубировались достаточно долго с антигенами или субстратом
2а. Аккуратно сливать избыток раствора перед промоканием вокруг среза.
2б. Пересмотреть рекомендуемое время инкубации

3. Избыточная фоновая окраска во всех стеклах
3а. Образцы с высокой эндогенной пероксидазной активностью
3б. Парафин не полностью удален




3в. Стекла плохо промыты


3г. Субстрат работает быстрее, чем должен (например, жарко в комнате)
3д. Срезы высыхают во время окраски


3е. Неспецифическое связывание реагентов срезами тканей
3ж. Слишком высокая концентрация антител
3а. Дольше использовать пероксидазный блок.
3б. Использовать свежие порции ксилола или толуола, если несколько стекол окрашиваются одновременно, вторая порция ксилола должна быть свежей.
3в. Использовать свежие порции буфера и промывочного буфера. Используйте TBST для промывки
3г. Меньше времени инкубировать в субстрат-хромогене

3д. Использовать влажную камеру. Промокать по 3-4 стекла одновременно перед применением реагента
3е. Применить блокирующий раствор, содержащий белок
3ж. Используйте более разведенное первичное антитело

ЗАМЕЧАНИЕ:
Если проблема не может быть определена в вышеуказанных случаях, или если предлагаемые корректирующие действия неудачны при решении проблемы, обратитесь в службу технической поддержки DakoCytomation за дальнейшей помощью.

Дополнительная информация по технике окраски и подготовке образцов может быть найдена в руководстве – иммуногистохимические методы9 (имеется в DakoCytomation), Атлас по иммуногистологии10 и иммунопероксидазные методы, практический подход к диагностике опухолей.11

Ссылки
Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976
Center for Disease Control Manual Guide - Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, Georgia. April 30, 1976. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts.
Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836
National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24-A:4
Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194
Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213
Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; 46
Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626
Naish SJ (ed). Handbook–immunochemical staining methods. Carpinteria: DakoCytomation 1989
Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986
Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986

Доплонительные ссылки
Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3-8
Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25
Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25
Bisgaard K. EnVision Plus–Introduction to a new technology. Abstract. DAKO Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25

20 января 2008. Перевод с английского: Пешков М. В.
15

Приложенные файлы

  • doc 7750217
    Размер файла: 106 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий