Ключевые слова: астрагал перепончатый, нейроны мозжечка, низкокалиевый апоптоз, глута-матная эксайтотоксичность, кальций.


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте файл и откройте на своем компьютере.
ВЕСТНИК ВГУ, СЕРИЯ: ХИМИЯ. БИОЛОГИЯ. ФАРМАЦИЯ, 2014, № 4 сультных больных [3]. езультаты исследований, полученные в последние 10 лет, свидетельствуют о том, что экстракт корня П и его отдельные ком поненты оказывают нейропротекторное действие при моделировании ишемии in vitro и in vivo. является потенциальным нейропротектором при лечении болезни Паркинсона, стимулирует рост периферических нервов, препятствует эксайто токсичности [4, 5, 6, 7]. Проведенные нами ранее исследования [8, 9] показали, что экстракты и корня, и надземной части П повышают устой чивость культивируемых нейронов мозга к глута матной эксайтотоксичности. При этом экстракты корня и надземной части обладают высокой и практически равной эффективностью. При гипоксии и ишемии мозга ведущим пато генетическим фактором повреждения нейронов является гиперстимуляция нейрональных рецеп торов возбуждающими аминокислотами [10, 11]. оксическое действие возбуждающего медиато ра глутамата – «феномен эксайтотоксичности» влечет за собой метаболические, медиаторные и структурные изменения нейронной сети с непре менным развитием некроза и апоптоза нейронов. Пусковым элементом процесса на пике развития феномена эксайтотоксичности выступает массив ное поступление в клетки ионов кальция [12]. другой стороны, апоптоз может быть вызван сни жением внутриклеточной концентрации [13]. аким образом, поддержание кальциевого гоме остаза является крайне важным для выживания нейронов. В связи c этим выяснение воздействия экстрактов П на гомеостаз в клетках пред ставляется весьма актуальным. ель работы – изучение влияния экстрактов корня и надземной части астрагала перепончато го на уровень кальция в нейронах мозга при экс айтотоксическом воздействии глутамата, а также на выживаемость нейронов при низкокалиевом апоптозе. ТОД НТА орни и надземная часть астрагала перепон чатого были собраны в окрестностях г. Улан-Уде (трава – в период массового цветения, в июле, корни – в сентябре). ырье высушивали, измель чали и готовили экстракты [14]. ля исследова ний применяли водные растворы экстрактов. В работе использованы 7–8-дневные культуры нейронов мозжечка, полученные от 7–9-дневных крысят методом ферментно-механической дис социации [15]. ультуры выращивали в 96-лу ночных планшетах, покрытых поли- -лизином, в культуральной среде, содержащей 10% эмбри ональной телячьей сыворотки, 2 м глутамина, 10 м буфера EPES, 25 м Cl. В культуры, использованные для определения влияния экс трактов на уровень , через 24 часа от начала культивирования был добавлен 1 мк арабино зидмоноцитозида для предотвращения пролифе рации не нейрональных клеток. ля исследования влияния экстрактов П на уровень кальция при глутаматной эксайто токсичности использовали флуоресцентный зонд Fluo-4 A , который внутри клетки расще пляется до Fluo-4, взаимодействующего со сво бодным кальцием и дающего флуоресценцию, регистрация которой и позволяет исследовать уровень кальция в нейронах. Fluo-4 вносили в культуральную среду на 30 мин в концентра ции 5 мк . Воздействие глутаматом осущест вляли в солевом растворе (м aCl - 154; Cl - 25; O - 0,35; CaCl - 2,3; - 3,6; глюкоза - 5,6; HEPES - 5 (pH ность воздействия глутамата составляла 10 мин, концентрация - 100 мк . По истечении 10 мин культуры промывали солевым раствором и пере носили в солевой раствор с экстрактами, либо в солевой раствор без экстрактов. онтрольные культуры помещали на 10 мин в солевой раствор без глутамата. сследуемые экстракты вноси ли в культуры в концентрации 90 мкг/мл после воздействия глутамата. змерение интенсивно сти флуоресценции производили спустя 60 мин после воздействия глутамата на многофункцио нальном ридере для микропланшетов Filter ax F5 при длине волны возбуждения 485 мкм, эмис сии 535 мкм. Перед измерением культуры триж ды промывали солевым раствором. езультаты измерения представлены в %, за 100% принима ли интенсивность флуоресценции контрольных культур. ндукцию апоптоза в культурах нейронов мозжечка крыс производили снижением концен трации ионов калия в культуральной среде спу стя 7 дней культивирования. ля экспериментов использовали бессывороточную среду [16]. меняли культуральную среду с 25 м на бес сывороточную с 5 м онтрольные культуры помещали в бессывороточную среду с 25 м В часть культур были добавлены экстракты корня или надземной части П в концентрации 90 мкг/ мл. пустя 24 часа культуры фиксировали ом, окрашивали трипановым синим и проводили под Шурыгина Л. В., Кравцов А. А., Злищева Э. И., Андросова Т. В., Злищева Л. И., Лобова Н. Н. счет числа живых и погибших нейронов на инвер тированном микроскопе. езультаты представле ны как процентная доля живых нейронов. татистическую обработку данных проводи ли в программе S CA 10 с использованием тьюдента. БСУЖД ИЕ ЕЗ УЛЬТАТОВ езультаты исследования влияния экстрактов П на выживаемость нейронов при низкокалие вом апоптозе представлены на рисунке 1. нализ данных показал, что при инкубации культур в те чение 24-х часов в бессывороточной среде с 5 м , наблюдается резкое сокращение числа живых нейронов (до 34,0±2,4%). Внесение в эту же среду экстрактов корня или надземной части астрагала перепончатого способствует увеличению доли живых нейронов на 10,3 и 9,7%, соответствен о есть, экстракты корня и надземной части астрагала оказывают статистически значимый и практически равный защитный эффект на нейро ны мозжечка в низкокалиевой среде, вызывающей апоптоз. В бессывороточной среде с 25 м экстракты астрагала перепончатого не оказыва ют влияния на выживаемость нейронов, их число остается на уровне контроля. аблица 1. Влияние экстрактов астрагала перепончатого на интенсивность флуоресценции Fluo-4 в культурах нейронов мозжечка при глутаматной эксайтотоксичности. нтенсивность флуоресценции Fluo-4, % онтроль кстракт корня кстракт надземной части Глутамат Глутамат + экстракт корня Глутамат + экстракт надземной части 94,8±11,4 * - р<0,05 в сравнении с группой «Глутамат». Рис. 1. Влияние экстрактов астрагала пере пончатого на выживаемость культивируемых ней ронов при низкокалиевом апоптозе. * - р<0,05 в сравнении с группой «5 м При изучении влияния экстрактов корня и надземной части астрагала перепончатого на кальциевый гомеостаз культивируемых нейро нов мозжечка при глутаматной эксайтотоксично сти (табл. 1) с использованием флуоресцентного зонда Fluo-4 A было установлено, что после воздействия глутамата концентрация кальция в нейронах резко (более чем в 4 раза) возрастает. При внесении в культуры нейронов мозжечка, об работанные глутаматом, экстракта корня астрага ла отмечалось статистически значимое снижение внутриклеточного уровня кальция. нижение концентрации кальция в нейронах мозжечка в ус ловиях глутаматной эксайтотоксичности отмеча лось и после внесения в культуру экстракта над земной части астрагала. днако эффект снижения уровня кальция в нейронах был ниже, чем при до бавлении экстракта корня. В отсутствии глутама та экстракты надземной части и корня астрагала перепончатого влияния на содержание кальция в нейронах не оказывают. аким образом, установлено, что экстракты корня и надземной части П увеличивают выжи ваемость нейронов мозжечка в условиях низкока лиевой среды, индуцирующей апоптоз. кстракт корня П достоверно снижает внутриклеточный уровень кальция в условиях глутаматной эксайто токсичности, менее выраженный эффект оказыва ет экстракт надземной части. звестно, что гибель нейронов при гипоксии/ ишемии мозга обусловлена гиперстимуляцией глутаматных рецепторов. ктивация ионотроп ных глутаматных рецепторов приводит к посту плению в клетку Ca и и выходу . В даль нейшем, в результате деполяризации клеточной начинает поступать в цитоплазму и по потенциал-зависимым Ca -каналам. В усло виях нормы поглощение митохондриями в значительной степени обеспечивает поддержание его концентрации на безопасном уровне. днако при гиперстимуляции глутаматных рецепторов продолжающийся массивный вход Ca в цито плазму приводит к перегрузке митохондрий. временем это приводит к отсроченной Ca дис регуляции ( ) - лавинообразному увеличению концентрации внутриклеточного Ca читается, что развивается в результате митохондриаль ной дисфункции и является этапом запуска необ ратимых процессов гибели нейронов [17, 18, 19]. Влияние экстрактов корня и надземной части астрагала перепончатого Применение экстрактов П в условиях глу таматной эксайтотоксичности способствует сни жению внутриклеточного уровня кальция. По- видимому, экстракты П снижают потенциал развития Ca -зависимых нейрональных дисфунк ций, сопровождающихся , и, в соответствии с этим, уменьшают гибель нейронов. звестно, что при помещении нейронов в среду с пониженной до 5 м концентрацией апоптоз связан со снижением внутриклеточной концентрации . Причиной последнего явля ется закрытие потенциал-зависимых -каналов плазматической мембраны в результате её реполя ризации [13]. лючевая роль кальция в выжива нии нейронов в среде с пониженным содержани подтверждается также тем, что применение агониста кальциевых каналов (Bay 8644) спо собствует лучшему выживанию нейронов, а при воздействии нифедипина - блокатора кальциевых каналов - нейроны гибнут и при высоких концен трациях ейроны умирают в результате апоп тоза, когда уровень кальция, опускается ниже определенного порогового значения в отсутствие агентов выживаемости [20]. Полагаем, что, возможно, экстракты П под держивают пороговый уровень Ca в нейронах и снижают -потребность для выживания нейро ЛЮЧ кстракты корня и надземной части астра гала перепончатого снижают внутриклеточный уровень кальция в условиях глутаматной эксай тотоксичности и увеличивают выживаемость ней ронов мозжечка в условиях низкокалиевой среды, индуцирующей апоптоз. Полагаем, что нейро протекторный эффект экстрактов астрагала пере пончатого может быть связан со стабилизацией кальциевого гомеостаза нейронов. Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант 12-04- Л РАТУРы Гусев шемия головного мозга / Гусев, В. кворцова. — Б арнаулов итотерапия в невроло гии / арнаулов, . Поспелова. — Пб. — D ecoction can improve recovery of neurological function, reduce infarction volume, stimulate neural proliferation and modulate VE F and Flk1 expressions in transient focal cerebral ischaemic rat brains / . Cai [et al.] // Journal of Ethnopharmacology. — 2007. — Vol. 113. — P. 292–299. V protects against ischemic brain injury in a murine model of transient focal uo [et al.] // etters. — 2004. — Vol. 363. — P. 218–223. n europrotective effects of Astragaloside V in 6-hydroxydopamine-treated primary nigral cell culture / .-S. Chan [et al.] // nternational. — 2009. — Vol. 55. — P. 414–422. Effect of Astragalus membranaceus in rats on peripheral nerve regeneration: in vitro and in vivo studies / u [et al.] // J. rauma. — 2010. — Vol. 68(2). — P. 434–440. I so�avonoids from Astragalus mongholicus protect PC12 cells from toxicity induced by l-glutamate u [et al.] // Journal of Ethnopharmacology. — 2005. — Vol. 98. — P. 89–94. Н ейропротекторный эффект экстрактов из надземной части Astragalus membranaceus и A. mongolicus (Fabaceae) в условиях токсического действия глутамата / .Я. Шурыгин [и др.] // тительные ресурсы. — 2012. — . 48. — № 2. — Н ейропротекторный эффект экстрактов корня и надземной части астрагала перепончатого в культуре нейронов мозжечка крыс при глутамат ной эксайтотоксичности / .В. Шурыгина [и др.] // Вестник урятского государственного универ ситета. — 2012. — № 2. — . 109–115. Olney J. . Brain lesions, obesity, and other disturbances in mice treated with monosodium glutamate / J. . Olney // Science. — 1969. — Vol. 164. — P. 719–721. 11. K ainic Acid as a ool in eurobiology / E. eer, J. . Olney, P. eer Eds. — — 1978. — P. 95–121. М атвеев .Г. еномен цитотоксичности и механизмы повреждения нейронов новой коры при гипоксии и ишемиии / .Г. атвеев // ихоо кеанский медицинский журнал. — 2004. — № 2. Apoptosis in cerebellar granule cells is blocked by high Cl, forskolin, and F-1 through distinct mechanisms of action: the involvement of intracellular calcium and R A synthesis / C. alli [et al.] // J. eurosci. — 1995. — Vol. 15. — P. 1172–1179. С околов правочник по лекарствен ным растениям / околов, амотаев — Шурыгина Л. В., Кравцов А. А., Злищева Э. И., Андросова Т. В., Злищева Л. И., Лобова Н. Н. Влияние хронической свинцовой инток сикации на радикалообразование в мозге и глу таматную нейротоксичность в культуре нейро нов мозжечка / равцов [и др.] // звестия высших учебных заведений. еверо- авказский стественные науки. — 2009. — № 5. — K -dependent Cerebellar Apoptosis / auritzen [et al.] // he Journal of Biological Chemistry. — 2003. — Vol. 278. — № — P. 32068–32076. О тсроченная дисрегуляция в моло дых нейронах мозжечка при гиперстимуляции глутаматных рецепторов, роль A-каналов / .В. Вабниц. [и др.] // иол. мембраны. — 2006. . 311–319. Р оль митохондрий в механизмах токсиче ского действия глутамата / саев [и др.] // K hodorov B. lutamate-induced deregulation of calcium homeostasis and mitochondrial dysfunction in mammalian central neurons / B. hodorov // Prog. ol. Biol. — 2004. — Vol. 86. — P. 279–351. n itochondria and Survival / icholls, S. . Budd // Physiol. Rev. — 2000. — Vol. 80. — P. 315–360. Шурыгина Людмила Васильевна — зав. отде лом биологически активных веществ, кандидат сельхоз. наук, старший науч. сотр., БО У ВП убанский государственный университет», тел. Кравцов Александр Анатольевич — науч. сотр. отдела биологически активных веществ, кандидат биол. наук, БО У ВП « убанский государствен ный университет»; e-mail: [email protected] Злищева Энна Ивановна — ведущий науч. сотр. отдела биологически активных веществ, кандидат биол. наук, старший науч. сотр., БО « убанский государственный университет»; Андросова Татьяна Васильевна — старший науч. сотр. отдела биологически активных ве ществ, БО У ВП « убанский государствен ный университет»; e-mail: [email protected] Злищева Лариса Ивановна — ведущий науч. сотр. отдела биологически активных веществ, кандидат биол. наук, БО У ВП « убанский го сударственный университет»; e-mail: [email protected] Лобова Наталья Николаевна — науч. сотр., отдела биологически активных веществ, БО убанский государственный университет; Shurygina Ludmila V. — head of of Biologically Active Substances « uban State niversity», candidate of agricultural sciences; Ph. 8 Kravtsov Aleksandr A. — research associate epartment of Biologically Active Substances uban State niversity», candidate of biological Zlischeva Enna I. — leading research associate epartment of Biologically Active Substances uban State niversity», candidate of biological Androsova Tatyana V. research associate epartment of Biologically Active Substances uban State niversity»; e-mail: [email protected] Zlischeva Larissa Ivanovna — leading research associate of epartment of Biologically Active Substances « uban State niversity», candidate of Lobova natalia nikolaevna — research associate epartment of Biologically Active Substances uban State niversity»; e-mail: [email protected] Влияние экстрактов корня и надземной части астрагала перепончатого ВЕСТНИК ВГУ, СЕРИЯ: ХИМИЯ. БИОЛОГИЯ. ФАРМАЦИЯ, 2014, № 4

Приложенные файлы

  • pdf 11159566
    Размер файла: 328 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий