Однонитевых разрывы днк, иммунокомпетентные клетки, флуоресцентная спектрофотометрия. После был выбран режим для измерения лейкоцитов при измерительном токе 200 мкА.


МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
(ФГБОУ ВПО «КубГУ»)
Физико-технический факультет
Кафедра радиофизики и нанотехнологийКУРСОВАЯ РАБОТА
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОДНОНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ ДНК В ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТКАХ
Работу выполнил _________________________ Василиади Роман Викторович
Курс 3
Направление 210100.62 Электроника и наноэлектроникаНаучный руководитель
канд. хим. наук, доцент _____________________________ Е.Е. Текуцкая
Нормоконтролерканд. хим. наук, доцент _______________________М.Е. Соколов
Краснодар 2014
РЕФЕРАТ
Курсовая работа 26 с., 2 рис., 14 источников.
ОДНОНИТЕВЫХ РАЗРЫВЫ ДНК, ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫЕ КЛЕТКИ, ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ
Объектом исследования данной работы являются однонитевые разрывы ДНК в иммунокомпетентных клетках.
Целью данной работы является ознакомление с методикой определения однонитевых разрывов ДНК в клетках крови и определение содержания однонитевых разрывов ДНК в иммунокомпетентных клетках при различных условиях инкубирования.
В результате выполнения курсовой работы, с помощью теоретических и экспериментальных данных была отработана методика определения однонитевых разрывов ДНК в клетках крови, изучено влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на лимфоциты, выделенные из крови крыс.
Введение............................................................................................................. 4
1 Строение молекулы ДНК и её роль в клетках…………..…....................... 5
2 Иммунокомпетентные клетки....................................................................... 8
3 Апоптоз – контролируемая гибель клеток………………………………... 11
4 Однонитевые разрывы ДНК.......................................................................... 13
5 Флуоресцентная спектрофотометрия........................................................... 15
6 Экспериментальная часть.............................................................................. 17
6.1 Выделение лимфоцитов из цельной крови крыс................................ 17
6.2 Инкубирование лимфоцитов в воде с измененным изотопным составом и определение однонитевых разрывов ДНК................................... 20
6.3 Изучение влияния воды с измененным изотопным составом на состояние ДНК лимфоцитов............................................................................. 22
Заключение......................................................................................................... 24
Список используемых источников................................................................. 25
СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
Однонитевые разрывы (ОР) в молекуле дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) являются самым многочисленным типом повреждения ДНК, который, наряду с двунитевыми разрывами, возникает либо при физиологических условиях в лимфоцитах, либо при патологических процессах, при окислительном стрессе, ионизирующем излучении, нарушении функционирования ферментов клеточного ядра. Данные повреждения ДНК происходят на наноуровне, так как ширина двойной спирали ДНК составляет от 2,2 до 2,4 нм.
Однонитевые разрывы репарируются по негомологичным концам ДНК на всех этапах клеточного цикла, представляющий основной механизм репарации в G1(гуанин) или гомологичных рекомбинациях в различных фазах клеточного цикла. ОР способны индуцировать апоптоз в ряде клеток [1]. Также ОР являются частым явлением в иммунокомпетентных клетках, при различных заболеваниях. Таким образом, мы можем рассматривать определение количества ОР ДНК как возможный инструмент диагностики различных заболеваний. Также мы можем с помощью определения однонитевых разрывов изучать влияние различных факторов окружающей среды на иммунокомпетентные клетки.
Целью данной работы является ознакомление с методикой определения ОР ДНК в клетках крови и определение содержания ОР ДНК в иммунокомпетентных клетках при различных условиях инкубирования.
Задачами данной работы являются: адаптация методики определения ОР ДНК для крови крыс, лизирование иммунокомпетентных клеток, определение числа однонитевых разрывов в лимфоцитах методом спектрофлуометрии.

1 Строение молекулы ДНК и её роль в клетках
Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) - молекула наследственности. ДНК обеспечивает хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. ДНК содержит информацию о структуре различных видов РНК и белков. ДНК-очень длинная нитевидная молекула, состоящая из большого числа рибонуклеотидов. Пуриновые и пирмидиновые основания ДНК несут генетическую информацию, тогда как сахарные и фосфатные группы выполняют структурную роль.
В клетках эукариот (животных, растений и грибов) ДНК находится в ядре клетки в составе хромосом, а также в некоторых клеточных органоидах (митохондриях и пластидах).
Остов ДНК имеет одинаковое строение на всем протяжении молекулы. Он состоит из остатков дезоксирибозы, связанных фосфодиэфирными мостиками. 3’-гидроксильная группа остатка сахара одного дезоксирибонуклеотида соединена с 5’-гидроксильной группой соседнего сахара фосфодиэфирной связью. Вариабельной в ДНК является последовательность оснований. В ДНК содержится четыре типа азотистых оснований: два пуриновых основания - аденин (A) и гуанин (G); два пирмидиновых основания - тимин (T) и цитозин (C). Основания одной из цепей соединены с основаниями другой цепи водородными связями согласно принципу комплементарности: аденин соединяется только с тимином, гуанин — только с цитозином. Последовательность нуклеотидов позволяет «кодировать» информацию о различных типах РНК, наиболее важными из которых являются информационные, или матричные (мРНК), рибосомальные (рРНК) и транспортные (тРНК). Все эти типы РНК синтезируются на матрице ДНК за счёт копирования последовательности ДНК в последовательность РНК, синтезируемой в процессе транскрипции, и принимают участие в биосинтезе белков (процессе трансляции). Помимо кодирующих последовательностей, ДНК клеток содержит последовательности, выполняющие регуляторные и структурные функции [2].
Полимер ДНК обладает довольно сложной структурой. Нуклеотиды соединены между собой ковалентно в длинные полинуклеотидные цепи. Эти цепи в подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, обладающих одноцепочечными ДНК-геномами) попарно объединяются при помощи водородных связей во вторичную структуру, получившую название двойной спирали. Ширина двойной спирали составляет от 22 до 24 Å [3].
С молекулами ДНК связаны два основополагающих свойства живых организмов — наследственность и изменчивость. В ходе процесса, называемого репликацией ДНК, образуются две копии исходной цепочки, наследуемые дочерними клетками при делении, таким образом образовавшиеся клетки оказываются генетически идентичны исходной. Генетическая информация реализуется при экспрессии генов в процессах транскрипции (синтеза молекул РНК на матрице ДНК) и трансляции (синтеза белков на матрице РНК).
Вплоть до 50-х годов XX века точное строение ДНК, как и способ передачи наследственной информации, оставалось неизвестным. Хотя и было доподлинно известно, что ДНК состоит из нескольких цепочек, состоящих из нуклеотидов, никто не знал точно, сколько этих цепочек и как они соединены. Структура двойной спирали ДНК была предложена Френсисом Криком и Джеймсом Уотсоном в 1953 году на основании рентгеноструктурных данных, полученных Морисом Уилкинсом и Розалинд Франклин, и «правил Чаргаффа», согласно которым в каждой молекуле ДНК соблюдаются строгие соотношения, связывающие между собой количество азотистых оснований разных типов (рисунок 1). Позже предложенная Уотсоном и Криком модель строения ДНК была доказана, а их работа отмечена Нобелевской премией по физиологии 1962 г [4].

200025-2540000(а) - Модель Уотсона - Крика, (б) - параметры спиралей В-, С- и Т-форм ДНК (проекции перпендикулярно оси спирали), (в)—поперечный разрез спирали ДНК в В-форме (заштрихованные прямоугольники изображают пары оснований), (г)—параметры спирали ДНК в А-форме, (д)—поперечный разрез спирали ДНК в А-форме
Рисунок 1 — Модели ДНК, спираль Уотсона - Крика
2 Иммунокомпетентные клетки
К иммунокомпетентным клеткам крови относят макрофаги и лимфоциты. Эти клетки совместно участвуют в инициации и развитии всех звеньев адаптивного иммунного ответа.
К иммунокомпетентным клеткам относятся:
Т-Лимфоциты - Субпопуляция лимфоцитов, отвечающая главным образом за клеточный иммунный ответ. Включает в себя субпопуляции Т-хелперов (дополнительно разделяются на Th1, Th2, а так же выделяют Th3, Th9, Th17, Th22), Т-цитотоксический лимфоциты, NKT. Включает в себя эффекторы и долгоживущие клетки-памяти. Функции разнообразны: как регуляторы и администраторы иммунного ответа (Т-хелперы), так и киллеры (Т-цитотоксические лимфоциты).
В-Лимфоциты - Субпопуляция лимфоцитов синтезирующая антитела и отвечающая за гуморальный иммунный ответ.
Нейтрофилы — это неделящиеся и короткоживущие клетки. Они составляют 95 % от гранулоцитов. Нейтрофилы содержат огромное количество антибиотических белков, которые содержатся в различных гранулах. К этим белкам относятся лизоцим (мурамидаза), липопероксидаза и другие антибиотические белки. Нейтрофилы способны самостоятельно мигрировать к месту нахождения антигена, так как у них есть рецепторы хемотаксиса (двигательная реакция на химическое вещество). Нейтрофилы способны «прилипать» к эндотелию сосудов и далее мигрировать через стенку к месту нахождения антигенов. Далее проходит фагический цикл, и нейтрофилы постепенно заполняются продуктами обмена. Далее они погибают и превращаются в клетки гноя.
Эозинофилы - клетки, составляющие 2—5 % от гранулоцитов. Способны фагоцитировать микробы и уничтожать их. Но это не является их главной функцией. Главным объектом эозинофилов являются гельминты. Эозинофилы узнают гельминтов и экзоцитируют в зону контакта вещества — перфорины. Эти белки встраиваются в билипидный слой клеток гельминта. В них образуются поры, внутрь клеток устремляется вода, и гельминт погибает от осмотического шока.
Базофилы - клетки, составляющие меньше, чем 0,2 % от гранулоцитов. Существуют две формы базофилов: собственно базофилы — базофилы, циркулирующие в крови и тучные клетки — базофилы, находящиеся в ткани. Тучные клетки располагаются в различных тканях, лёгких, слизистых и вдоль сосудов. Они способны вырабатывать вещества, стимулирующие анафилаксию (расширение сосудов, сокращение гладких мышц, сужение бронхов). При этом происходит взаимодействие с иммуноглобулином Е (IgE). Таким образом они участвуют в аллергических реакциях. В частности, в реакциях немедленного типа.
Моноциты - клетки, превращающиеся в макрофаги при переходе из кровеносной системы в ткани, существуют несколько видов макрофагов в зависимости от типа ткани, в которой они находятся, в том числе:
Некоторые антигенпредставляющие клетки, роль которых — поглощение микробов и «представление» их Т-лимфоцитам.
Клетки Купфера — специализированные макрофаги печени, являющиеся частью ретикулоэндотелиальной системы.
Альвеолярные макрофаги‬‏ — специализированные макрофаги легких.
Остеокласты — костные макрофаги, гигантские многоядерные клетки позвоночных животных, удаляющие костную ткань посредством растворения минеральной составляющей и разрушения коллагена.
Микроглия — специализированный класс глиальных клеток центральной нервной системы, которые являются фагоцитами, уничтожающими инфекционные агенты и разрушающими нервные клетки.
Функции их разнообразны и включают в себя фагоцитоз, взаимодействие с адаптивной иммунной системой и инициацию и поддержание иммунного ответа, поддержание и регулирование процесса воспаления, взаимодействие с нейтрофилами и привлечение их в очаг воспаления, выделение цитокинов, регуляция репарации, регуляция процессов свертывания крови и проницаемости капилляров в очаге воспаления, синтез компонентов системы комплемента.
Натуральные киллеры (NK-клетки) — субпопуляция лимфоцитов, обладающая цитотоксичной активностью, то есть они способны: контактировать с клетками-мишенями, секретировать токсичные для них белки, убивать их или отправлять в апоптоз. Натуральные киллеры распознают клетки, поражённые вирусами и опухолевые клетки [5].

3 Апоптоз - контролируемая гибель клеток
Апоптоз и некроз - два разных механизма отмирания индивидуальных клеток тканей, органов человека и животных. Эти варианты характеризуются различными морфологическими и молекулярными явлениями и разным влиянием на окружающие ткани.
Апопто́з (др.-греч. — опадание листьев) — регулируемый процесс программируемой клеточной гибели, в результате которого клетка фрагментируется на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной. Фрагменты погибшей клетки обычно очень быстро фагоцитируются макрофагами либо соседними клетками, минуя развитие воспалительной реакции.
Другая форма гибели клетки - некроз возникает как патологический процесс в результате воздействия на нее внешнего повреждающего фактора. Синоним термина некроз - «гибель клетки от повреждения». Одним из основных механизмов гибели клетки вследствие некроза является повреждение ее плазматической мембраны, лизис, что приводит к нарушению ее ионного состава, набуханию мембранных органелл, разрыву лизосомальных мембран и, как следствие, деструкции цитоплазматических структур. Во внеклеточном пространстве продукты деструкции некротических клеток вызывают воспалительный процесс. В дальнейшем клеточный детрит поглощается фагоцитами [6]. Обычно некроз характерен для нескольких клеток, формирующих группы, в то время как апоптоз может наблюдаться в одной клетке.
В отличие от некроза апоптоз - не обязательно проявление патологического процесса. Этот важный внутриклеточный процесс часто инициируется во время нормального жизненного цикла клетки с целью поддержания гомеостаза в организме. Апоптоз является важным механизмом изменения численности клеток в развитии организма. Существует множество физиологических процессов (наблюдающихся в основном в ходе морфогенеза или поддержания нормального состава обновляющихся клеточных популяций), когда клетки, завершившие свой жизненный цикл, удаляются путем апоптоза.
Апоптоз контролируется различными клеточными сигналами, которые носят экстраклеточный или интраклеточный характер [6, 7] и приводят к повреждению ДНК [7]. В процесс апоптоза клетки вовлекаются с увеличением возраста, под действием ультрафиолета, химических или физических факторов, токсинов, гормонов, факторов роста, оксида азота и др., а также при таких заболеваниях, как СПИД, болезнь Альцгеймера и Паркинсона, инфаркт миокарда, остеопороз, остеоартроз и др.

4 Однонитевые разрывы ДНК
Одно- и двунитевые разрывы ДНК являются частыми событиями в эукариотических клетках: либо при физиологических условиях в лимфоцитах, либо при патологических процессах, при окислительном стрессе, ионизирующем излучении, нарушении функционирования ферментов клеточного ядра.
На сегодняшний день образование ОР в процессе апоптозной гибели выделяют в отдельный тип деградации ДНК в гибнущих клетках, отличный от крупнофрагментарной деградации и межнуклеосомной деградации хроматина [8]. Роль этого типа деградации в механизме гибели клетки остается пока неясной.
ОР являются самым многочисленным типом повреждения ДНК: они сопровождают действие очень многих агентов и являются вторичными, промежуточными дефектами при функционировании эксцизионной репарации. Такая "вездесущность" ОР сочетается с устойчивым представлением об их нелетальности [9]. В то же время ОР способны индуцировать апоптоз в ряде клеток [1]. Учитывая это обстоятельство, ОР представляют большой интерес для изучения взаимосвязи механизмов репарации и апоптоза.
Репарация и апоптоз противоположно направлены: первый восстанавливает поврежденную структуру ДНК, второй удаляет из популяции клетки, содержащие повреждения. По крайней мере часть разрывов, возникающих на начальных этапах апоптоза, может быть репарирована [10]. Репарация ДНК и апоптоз энергозависимы и могут конкурировать за энергоресурсы клетки. Эта конкуренция может влиять на картину гибели клетки, изменяя ее от типичного апоптоза до некроза [11].
Во многих исследованиях показана обратная корреляция частоты апоптоза с эффективностью репарации ДНК [12].
Есть версия, что только начальные повреждения ДНК являются сигналом, запускающим апоптоз, и дальнейшая их судьба (включая репарацию) не влияет на развитие апоптоза.

5 Флуоресцентная спектрофотометрияФлуоресцентная спектрофотометрия - это измерение флуоресценции, то есть фотолюминесценции, испускаемой веществом, подвергнутым воздействию света, ультрафиолетового или другого электромагнитного излучения. Как правило, максимум интенсивности света, испускаемого флуоресцирующим раствором, обнаруживается при длине волны, большей чем максимум возбуждающего света обычно на 20-30 нм [13].
Интенсивность света, испускаемого флуоресцирующим раствором, при определенных условиях находится в простой зависимости от концентрации растворенного вещества и, следовательно, может быть использована для анализа. Трудно, однако, измерить абсолютную интенсивность флуоресценции, и обычно измерения проводят по отношению к разведениям правильно выбранного стандартного образца. Общая схема флуоресцентной спектроскопии состоит в возбуждении флуоресценции излучением при длине волны максимума поглощения и в измерении или сравнении интенсивности флуоресцирующего света с флуоресценцией определенного стандартного раствора. Флуоресцирующий свет должен быть тщательно отделен от рассеянного света, падающего на вещество.
Интенсивность флуоресценции - эмпирическое выражение флуоресцентной активности, обычно проводимое в условных единицах, пропорциональных ответу детекторов.
Спектр флуоресцентного излучения - обычное представляемое в графической форме отношение интенсивности испускаемого излучения к длине волны.
В данной работе использовался флуоресцентный спектрофотометр HITACHI F-2700 . Основные технические характеристики:
- источник света – 150 Вт ксеноновая лампа с самодеозонированием;
- монохроматор – безаберрационная вогнутая дифракционная решетка большого диаметра 900 линий/мм. Длина волны блеска: EX зона 300 нм, EM зона 400 нм;
- диапазон длин волн – 220-730 нм и свет 0-порядка в зонах EX и EM (индикация длины волны 220-800 нм и свет 0-порядка);
- чувствительность – отношение сигнал/шум 250 (межпиковое) и более; излучение при комбинационном рассеянии: EX длина волны 350 нм; щель (обе зоны EX и EM): 5 нм; отклик 2 с.
- скорость сканирования длины волны – 60, 300, 1500, 3000, 12000, нм/мин (при управлении ПК)

6 Экспериментальная часть
В данной работе исследовалось влияние воды с пониженным содержанием дейтерия (40±2ppm) на функциональные свойства иммунокомпетентных клеток крови (лимфоцитов). Для этого определялось количество однонитевых разрывов ДНК в лизатах лимфоцитов, выделенных из цельной крови отобранной у двух групп крыс: одна контрольная (К), другая опытная (О). Опытная группа крыс употребляла воду с пониженным содержанием дейтерия в течении двух недель. Предварительно клетки инкубировали в физиологическом растворе на легкой (опытные образцы) и обычной воде (контрольные образцы). Однонитевые разрывы ДНК являются начальным этапом фрагментации молекулы ДНК и предшествуют переходу клетки в состояние апоптоза (гибели).
6.1 Выделение лимфоцитов из цельной крови крыс
Для определения концентрации иммунокомпетентных клеток в крови крыс использовался счетчик форменных элементов крови «Пикоскель ПС-4М». Данный счетчик используется в медицинской практике для счета форменных элементов крови: числа эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов.
Для «Пикоскеля ПС-4М» наиболее важными техническими характеристиками являются:
- определяемая концентрация форменных элементов крови от 2·103 до 105 см-3;
- определяемые размеры форменных элементов от 2 до 12 мкм;
- систематическая погрешность не более 15 %;
- случайная погрешность не более 4%;
- время измерения одной пробы не более 40 с.
Работа счётчика форменных элементов крови «Пикоскель ПС-4М» построена на принципе измерения импеданса и реализована на счёте электрических импульсов, вызванных исследуемыми частицами, проходящими через отверстие измерительной трубки. Исследуемые частицы помещаются с помощью дозирующих устройств в электропроводящую жидкость (электролит), который совместно с ними представляет собой вид суспензии.
При запуске цикла измерения в измерительной трубке возникает вакуум, под действием которого находящиеся в электролите частицы засасываются в измерительную трубку через отверстие. Когда уровень суспензии внутри измерительной трубки достигает первого внутреннего электрода, между ним и внешним электродом протекает постоянный по величине измерительный ток. Электрическое сопротивление между электродами значительно изменяется каждый раз, когда через отверстие измерительной трубки проходят частицы с электропроводимостью, отличающейся от электропроводимости электролита. Изменение сопротивления создает импульсы напряжения. Подключенный к электродам регистрирующий узел может определить концентрацию частиц. Когда внутри измерительной трубки уровень суспензии достигает второго внутреннего электрода, в измерительной трубке создаётся давление, под действием которого тот же самый объём суспензии из неё выталкивается и находящиеся в нём частицы снова проходят через измерительную трубку.
Подсчёт частиц всегда происходит в постоянном объёме измерительной трубки, ограниченной первым и вторым внутренними электродами. По окончании цикла измерения результаты счёта можно снять с дисплея счётчика или распечатать.
Для определения значения фона была установлена измерительная трубка, затем в измерительный стакан налили 10 мл чистого физиологического раствора с последующим добавлением трех капель гемолитика. Далее стакан с физиологическим раствором был установлен на столик. После был выбран режим для измерения лейкоцитов при измерительном токе 200 мкА.
Для проведения данного опыта была использована цельная кровь, отобранная у двух групп крыс: одна контрольная (К), другая опытная (О). Опытная группа крыс употребляла воду с пониженным содержанием дейтерия в течении двух недель.
Проведение измерения числа лейкоцитов производилось следующим образом. Измерительная трубка была установлена на 100 мкм, затем был выбран режим счета лейкоцитов WBC, с последующим выбором тока 200 мкА. Далее разбавляем кровь физиологическим раствором в пропорции 1:630 (16 мкл крови на 10 мл физиологического раствора) и добавляем три капли гемолизируюющего раствора (гемолитика). Спустя три минуты полученный раствор был установлен на измерительный столик и производим счет лейкоцитов.
Для выделения лимфоцитарной массы из цельной крови была использована методика, описанная в работе [14]. Метод основан на разделении клеток крови при центрифугировании в градиенте плотности фиколла-урографина.
За сутки до выделения лимфоцитов из цельной крови, необходимо приготовить раствор фиколла-урографина с плотностью 1,093 г/мл. Раствор фиколла-урографина готовился следующим образом: в небольшом количестве дистиллированной теплой воды растворили 4,1 г фиколла 400, добавили 10 мл 76 % урографина и добавили дистиллят. Приготовленный раствор оставили на сутки. На следующий день довели водой до нужной плотности. Плотность раствора измеряли с помощью ареометра.
Для каждого исследуемого образца промаркировали по два эппендорфа вместимостью 1,5 мл - К и О. В пробирки, маркированные К, внесли с помощью дозатора по 500 мкл 0,9 % раствора NaCl стерильного, а затем таким же образом, поместили 500 мкл цельной крови и аккуратно смешали кровь с физраствором, тем самым стабилизировав кровь.
В эппендорфы, маркированные О, стерильных, внесли по 500 мкл фиколл-урографина. На фиколл-урографин аккуратно, избегая смешивания, наслаивали стабилизированную кровь, а затем, закрыв эппендорфы, поместили их в центрифугу Sigma 1-14 на 20 мин при скорости вращения равной 400 об/мин. По истечению 20 мин, содержимое эппендорфа представляло собой следующий гетерофазный раствор. На дно выпадал осадок красного цвета из эритроцитов и тромбоцитов, т. к. их плотность выше плотности фиколла-урографина. Надосадочная жидкость разделилась на две фазы: прозрачная - фиколл-урографин и красная жидкость, представляющая собой плазму крови. На границе раздела этих двух фаз образовалось кольцо из бело-желтых сгустков, содержащее лимфоциты. С помощью микродозатора производился сбор межфазного кольца, содержимое которого было помещено в отдельный стерильный эппендорф для дальнейшей отмывки клеток от примесей. Для отмывки клеток был добавлен физраствор в количестве 500 мкл, а затем эппендорфы снова были помещены в центрифугу на 10 мин со скоростью вращения 400 об/мин. После этого отбирали надосадочную жидкость. Выделенные лимфоциты цельной крови можно хранить при температуре минус 20 0С.
6.2 Инкубирование лимфоцитов в воде с измененным изотопным составом и определение однонитевых разрывов ДНК
Лимфоциты, изолированные из крови, инкубировались в течение 16 часов при комнатной температуре в физиологическом растворе, приготовленном на воде с пониженным содержанием дейтерия (40 ± 2 ppm) и обычной воде (150 ± 2ppm). Это необходимо для того, что бы выяснить, как влияет легкая вода на жизнеспособность клеток in vitro. Для выяснения влияния времени инкубирования на жизнеспособность лимфоцитов, последние вымачивались в физрастворе, приготовленном на легкой воде в течение 16 часов.
Для инкубирования две пробы лимфоцитов, выделенных из крови опытных и контрольных групп крыс, замачивали в 1 мл физиологического раствора на легкой воде, а две другие аналогичные пробы замачивали в физиологическом растворе на обычной воде.
Для лизирования клеток был приготовлен 4,5М раствор мочевины. Мочевина является детергентом, используется в биологических и биохимических лабораториях, представляет собой мягкий реагент, который используются для разрушения мембраны клеток (лизиса клеток) и трансформации внутриклеточного материала в растворимую форму. Детергенты используются в основном для разрушения межбелковых, белково-липидных и межлипидных связей, денатурации белковых структур, предотвращения неспецифического связывания в иммунохимических анализах и кристаллизации белков. После инкубирования во все пробы было добавлено по 0,2 мл 4,5М раствора мочевины. Клетки лизировали в течение 10 мин при комнатной температуре. В этом случае происходит разрушение оболочки лимфоцитов, тем самым высвобождение молекулы ДНК.
Лизаты клеток в экспериментальных образцах подвергались щелочной обработке в течение 30 мин при 0 0С, а затем 60 минут при 15 0С. Для этого во все пробы добавлялось по 0,2 мл 0,1 % HCl. Далее образцы подвергались интенсивному встряхиванию на Вортексе. Этим достигалось расплетание молекул ДНК.
После щелочной обработки лизатов в образцы добавлялся раствор бромистого этидия. Это химическое вещество из группы фенантридинов (3,8-диамино-6-этил-5-фенилфенантридиумбромид), широко применяемое для флуоресцентной маркировки ДНК. При облучении бромистый этидий флюоресцирует оранжевым цветом. Является интеркалирующим агентом, т. е. веществом, способным встраиваться между основаниями ДНК, его интеркаляция сопровождается раскручиванием суперспирализованных участков ДНК. Используется в качестве красителя для детектирования двухцепочечных молекул ДНК и РНК.
Интенсивность флуоресценции полученных образцов определялась на спектрофлуориметре Hitachi F-2700 в диапазоне длин волн 500-740нм.
Количество однонитевых разрывов ДНК оценивалось по отношению величин флуоресценции контрольных и экспериментальных образцов. Для снятия фоновой флуоресценции подготовили образец, содержащий все компоненты, как в экспериментальных образцах и в той же концентрации, но без молекул ДНК. Помещаем образец в кюветное отделение. На приборе выбираем режим флуориметрии. Затем задаем длину волны возбуждения – 540 нм, спектральный диапазон регистрации 500-740 нм. Далее нажимаем кнопку старт. Измерение флуоресценции в данном диапазоне идет около 2 минут для каждого образца. Полученные графики экспортируем непосредственно в электронную таблицу Excel для дальнейшего анализа результатов.
6.3 Изучение влияния воды с измененным изотопным составом на состояние ДНК лимфоцитов
Для изучения влияния воды с пониженным содержанием дейтерия на жизнеспособность иммунокомпетентных клеток in vitro, лимфоциты, изолированные из крови контрольной группы крыс и опытной, инкубировались в физрастворах, приготовленных на воде с природным содержанием дейтерия (содержание D 150 ± 2 ppm) и на воде с измененным изотопным составом (содержание D 40 ± 2 ppm). После лизирования клеток и соответствующей обработки растворов получены данные: в контрольной группе в крови, замоченной в физиологическом растворе на обычной воде, на 22,96% больше ОР, чем в растворе на легкой воде (отношение интенсивностей флюоресценции составляет 77,04 %); в опытной группе в крови, замоченной в физиологическом растворе на обычной воде, на 52,01% больше ОР, чем в растворе на легкой воде (отношение интенсивностей флюоресценции составляет 47,99%)

Рисунок 2 - Отношение интенсивностей флюоресценции раствора бромистого этидия с лизатами лимфоцитов крови контрольной и опытной групп.
Таким образом, в ходе выполнения эксперимента показано, что вода с пониженным содержанием дейтерия является либо ингибитором апоптоза иммунокомпетентных клеток, либо активирует их ДНК-репарирующие системы.
Среда с пониженным содержанием дейтерия создает более благоприятные условия функционирования клеток иммунной системы, о чем свидетельствует большая сохранность лимфоцитов при инкубации в подобной среде.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, мы можем сделать вывод, что определение однонитевых разрывов ДНК в иммунокомпетентных клетках может стать инструментом для исследования воздействия тех или иных веществ на живой организм. С помощью спектрофлюориметра Hitachi F-2700 были определены интенсивности флюоресценции раствора бромистого этидия, используемого в качестве красителя для детектирования двухцепочечных молекул ДНК и РНК, тем самым определено количество однонитевых разрывов в лимфоцитах крови крыс. В ходе выполнения эксперимента было показано, что вода с измененным изотопным составом защищает ДНК лимфоцитов от разрушения, либо активирует процессы репарации.
На основе полученных данных мы можем сделать прогноз, что легкая вода может быть использована как дополнительное средство для профилактики и лечения заболеваний.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1 Yoshida K. Three asparagine synthetase genes of Bacillus subtilis / K. Yoshida // J. Bacteriol - 1999. - № 181. - P. 6081–6091.
2 Страйер Л. Биохимия: В 3-х т. Т.3 / Л. Страйер. - М.: Мир, 1985. - 400 с.
3 Альбертс Б. Молекулярная биология клетки в 3-х томах / Б. Альбертс, Д. Брей, Дж. Льюис — М.: Мир, 1994. — 1558 с.
4 Уотсон Дж. Д. Двойная спираль: воспоминания об открытии структуры ДНК / Дж. Д. Уотсон — М.: Мир, 1969. — 152 с.
5 Ярилин А. А. Иммунология: учебник / Ярилин А. А.- М.: ГЕОТАР, 2010. - 737 с.
6 Молекулярные механизмы апоптоза / В. К. Кухта, Н. В. Морозкина, Е. В. Богатырева, и др. // БМЖ. - 2004. - № 1. - С. 1-8.
7 Brune B. Nitric oxide: NO apoptosis or turning it ON? / B. Brune // Cell Death Differ. - 2003. - Vol. 10. - № 8. - P. 864-869.
8 Bortner C. D. The role of DNA fragmentation in apoptosis / C. D. Bortner, N. B. E. Oldenburg, J. A. Cidlowski, // Trends Cell Biol. - 1995.-Vol. 5. - P. 21-25.
9 Cohen-Jonathan E. How does radiation kill cells / E. Cohen-Jonathan // Curr Opin Chem Biol - 1999. - Vol. 3 - P. 77-83.
10 Khodarev N.N. Dose-dependent and independent temporal patterns of gene responses to ionizing radiation in normal and tumor cells and tumor xenografts / N.N. Khodarev // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2001. - № 98. - P. 12665–12670.
11 Eguchi, Y. Intracellular ATP levels determine cell death fate by apoptosis or necrosis / Y. Eguchi // Cancer Res. - 1997. - № 57. - P. 1835-1840.
12 Götz C. DNA-damage, DNA repair and apoptosis / C. Götz, M. Montenarh // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. - 1995. - Vol. 127 - P. 65-95.
13 Всемирная организация здравоохранения Международная фармакопея. Том 1. Общие методы анализа / ВОЗ - М.: «Книга по требованию» - 1981. - 242 с.
14 Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow / A. Boyum // Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation. - 1968. - Vol. 21. - № 97. - P. 1-9.

Приложенные файлы

  • docx 7854137
    Размер файла: 463 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий